近期已經(jīng)證明，細(xì)胞外囊泡 (EV) 攜帶 DNA。然而，EV中 DNA (EV-DNA) 的許多基本特征仍然難以捉摸。
2022年4月4日，廈門(mén)大學(xué)顏曉梅團(tuán)隊(duì)在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在線(xiàn)發(fā)表題為“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究論文，該研究通過(guò)納米流式細(xì)胞儀 (nFCM) 可以檢測(cè)直徑小至 40 nm 的單個(gè) EV 和 SYTO 16 染色后 200 bp 的單個(gè) DNA 片段，用于研究單個(gè)囊泡處的 EV-DNA。
通過(guò)同時(shí)對(duì)單個(gè)顆粒進(jìn)行側(cè)向散射和熒光 (FL) 檢測(cè)并結(jié)合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實(shí)體相關(guān)的 DNA 大量存在于由細(xì)胞培養(yǎng)物制備的 EV 樣品中（超速離心培養(yǎng)基）；(2) 單個(gè) EVs 中 EV-DNA 的數(shù)量表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性，DNA 陽(yáng)性 (DNA+) EVs 的數(shù)量在 30% 到 80% 之間變化，具體取決于細(xì)胞類(lèi)型；(3) 外部 EV-DNA 主要定位在相對(duì)較小的 EVs 上（例如，HCT-15 細(xì)胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的分泌可以通過(guò)抑制外泌體分泌途徑顯著減少；(4) 內(nèi)部 EV-DNA 主要封裝在相對(duì)較大的 EV 的管腔內(nèi)（例如 HCT-15 細(xì)胞系為 80-200 nm）；(5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外部和內(nèi)部 EV-DNA 的主要形式；(6) EVs 中未發(fā)現(xiàn)組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不相關(guān)，(7) 基因毒性藥物誘導(dǎo) DNA+ EVs 的釋放增加，外部DNA+ EVs和內(nèi)部DNA+ EVs的數(shù)量以及單個(gè)EVs中的DNA含量均顯著增加。這項(xiàng)研究為深入了解 DNA 與EV的關(guān)聯(lián)提供了直接和確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
細(xì)胞外囊泡 (EVs) 是由幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型分泌的納米級(jí)膜囊泡，通過(guò)將蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。研究表明，EV中存在基因組 DNA、線(xiàn)粒體 DNA 甚至病毒 DNA。通過(guò) DNA 的包裝和水平轉(zhuǎn)移，EV 在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮著重要的作用。
基于 EV 中的 DNA (EV-DNA) 開(kāi)發(fā)了用于腫瘤診斷的液體活檢測(cè)試。盡管已經(jīng)認(rèn)識(shí)到 EV-DNA 的生物學(xué)意義，但對(duì) EV-DNA 的探索較少，許多基本特征仍存在爭(zhēng)議，例如 DNA 是否與所有或部分 EV 亞群相關(guān)？EV-DNA 是否位于內(nèi)腔和/或 EV 表面？DNA含量和EV大小之間有什么關(guān)系？EV-DNA 是單鏈 DNA (ssDNA) 還是雙鏈 DNA (dsDNA)？對(duì) EV-DNA 的研究通常通過(guò)從 EV 分離物中提取 DNA，然后進(jìn)行豐度、片段長(zhǎng)度和序列評(píng)估來(lái)進(jìn)行。通過(guò)將 DNase 酶消化與 Fragment Analyzer 系統(tǒng)相結(jié)合，研究了 DNA 的相對(duì)豐度和定位（管腔內(nèi)或與 EV 表面相關(guān)）。為了闡明 EV-DNA 在 EV 亞群之間的異質(zhì)性，對(duì)分離的 EV 進(jìn)行 DNA 分析通過(guò)密度梯度離心或不對(duì)稱(chēng)流場(chǎng)-流分餾已經(jīng)進(jìn)行。盡管批量分析能夠識(shí)別不同 EV 亞群中的 DNA，但結(jié)果可能存在爭(zhēng)議，因?yàn)?EV-DNA 無(wú)法與無(wú)細(xì)胞 DNA 區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于 EV 的大小和貨物含量差異很大，因此迫切需要單粒子技術(shù)來(lái)破譯 EV-DNA 的內(nèi)在異質(zhì)性，并將 EV-DNA 與游離 DNA 或其他污染物區(qū)分開(kāi)來(lái)。然而，EV 的納米級(jí)粒徑（大多數(shù)大小 <100 nm）和 EV-DNA 的低含量使其成為一個(gè)挑戰(zhàn)。
在過(guò)去的十年中，研究人員一直致力于開(kāi)發(fā)一種高靈敏度的納米流式細(xì)胞儀。它已實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè) EV、病毒、二氧化硅納米粒子和金納米粒子的光散射檢測(cè)，分別小至 40、27、24 和 7 nm。對(duì)于熒光 (FL) 檢測(cè)，檢測(cè)到單個(gè) R-藻紅蛋白分子的信噪比為 17，有機(jī)染料的檢測(cè)限確定為三個(gè) Alexa Fluor 532 分子。
在本研究中，嘗試通過(guò)將酶消化與 nFCM 相結(jié)合，在單囊泡水平上分析外部和內(nèi)部 EV-DNA。研究了 DNA+ EV 的百分比以及 DNA 含量分布與 EV 大小、ssDNA 和 dsDNA 之間的區(qū)別、EV-DNA 和組蛋白的關(guān)聯(lián)以及抗癌藥物治療后 DNA 含量的改變。通過(guò)同時(shí)對(duì)單個(gè)顆粒進(jìn)行側(cè)向散射和熒光 (FL) 檢測(cè)并結(jié)合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實(shí)體相關(guān)的 DNA 大量存在于由細(xì)胞培養(yǎng)物制備的 EV 樣品中（超速離心培養(yǎng)基）； (2) 單個(gè) EVs 中 EV-DNA 的數(shù)量表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性，DNA 陽(yáng)性 (DNA+) EVs 的數(shù)量在 30% 到 80% 之間變化，具體取決于細(xì)胞類(lèi)型； (3) 外部 EV-DNA 主要定位在相對(duì)較小的 EVs 上（例如，HCT-15 細(xì)胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的分泌可以通過(guò)抑制外泌體分泌途徑顯著減少； (4) 內(nèi)部 EV-DNA 主要封裝在相對(duì)較大的 EV 的管腔內(nèi)（例如 HCT-15 細(xì)胞系為 80-200 nm）； (5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外部和內(nèi)部 EV-DNA 的主要形式； (6) EVs 中未發(fā)現(xiàn)組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不相關(guān)，(7) 基因毒性藥物誘導(dǎo) DNA+ EVs 的釋放增加，外部DNA+ EVs和內(nèi)部DNA+ EVs的數(shù)量以及單個(gè)EVs中的DNA含量均顯著增加。這項(xiàng)研究為深入了解 DNA 與EV的關(guān)聯(lián)提供了直接和確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
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